ukurasa_bango

Habari

Mbinu na Matumizi ya Kanuni ya Fluorescence Kiasi cha Wakati Halisi

PCR ya muda halisi ya kipimo cha fluorescence ni mbinu ya kupima jumla ya kiasi cha bidhaa baada ya kila mzunguko wa mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi (PCR) katika mmenyuko wa ukuzaji wa DNA kwa kutumia fluorophore.Mbinu hiyo hutumika kukadiria mfuatano mahususi wa DNA katika sampuli ili kujaribiwa kwa mbinu za marejeleo ya ndani au nje.Tangu kuanzishwa kwake, majaribio ya upimaji wa PCR ya umeme yamezidi kuwa maarufu kwa walimu wa maabara.

Kanuni ya PCR ya Fluorescence: Fluorescence PCR, iliyoitwa kwanza TaqManPCR na baadaye pia Real-TimePCR, ni mbinu mpya ya kukadiria asidi ya nukleiki iliyotengenezwa na PE (PerkinElmer) nchini Marekani mwaka wa 1995. Mbinu hiyo inategemea kuongezwa kwa kichunguzi kilicho na lebo ya umeme au sambamba. rangi ya fluorescent kwa PCR ya kawaida ili kufikia utendaji wake wa kiasi.Kanuni: kadiri mmenyuko wa PCR unavyoendelea, bidhaa za mmenyuko wa PCR hujilimbikiza na ukubwa wa mawimbi ya umeme huongezeka kwa uwiano sawa.Kwa kila mzunguko, mawimbi ya kiwango cha mwanga wa umeme hukusanywa ili tuweze kufuatilia mabadiliko ya kiasi cha bidhaa kwa mabadiliko ya kiwango cha umeme na hivyo kupata grafu ya mkunjo ya ukuzaji wa fluorescence.

Fluorescence ya wakati halisi3
Fluorescence ya wakati halisi2

Kwa ujumla, Curve ya amplification ya fluorescence inaweza kugawanywa katika awamu tatu: awamu ya ishara ya mandharinyuma ya fluorescence, awamu ya ukuzaji wa ishara ya fluorescence na awamu ya tambarare.Wakati wa awamu ya mawimbi ya usuli, mawimbi ya umeme yaliyoimarishwa hufunikwa na mawimbi ya usuli ya umeme na mabadiliko katika kiasi cha bidhaa hayawezi kubainishwa.Katika awamu ya uwanda wa juu, bidhaa ya ukuzaji haiongezeki tena kwa kasi, hakuna uhusiano wa mstari kati ya kiasi cha bidhaa ya mwisho na kiasi cha kiolezo cha kuanzia, na nambari ya kuanzia ya nakala ya DNA haiwezi kuhesabiwa kulingana na kiasi cha mwisho cha bidhaa ya PCR.Ni katika awamu ya ukuzaji mwangaza wa mawimbi ya umeme pekee ndipo kuna uhusiano wa mstari kati ya logariti ya kiasi cha bidhaa ya PCR na kiasi cha kiolezo cha kuanzia, na tunaweza kuchagua kubainisha hili katika hatua hii.Kwa urahisi wa kuhesabu na kulinganisha, dhana mbili muhimu sana zimeanzishwa katika mbinu ya upimaji wa wakati halisi wa umeme wa PCR: kizingiti cha fluorescence na thamani ya CT.

Kizingiti ni thamani iliyowekwa kisanii kwenye mkondo wa ukuzaji wa fluorescence.awamu ya kielelezo ya ukuzaji wa PCR.

Thamani ya Ct: ni idadi ya mizunguko ambayo mawimbi ya umeme katika kila bomba la majibu imepitia ili kufikia thamani ya kikoa iliyowekwa.

Uhusiano kati ya thamani ya Ct na kiolezo cha kuanzia: tafiti zimeonyesha kuwa thamani ya Ct ya kila kiolezo ina uhusiano wa kimstari na logariti ya nambari ya nakala ya kuanzia ya kiolezo hicho, kadiri nakala zinavyoongezeka za nambari ya kuanzia, ndivyo Ct inavyokuwa ndogo. thamani.Thamani za Ct ni thabiti.Mviringo wa kawaida unaweza kufanywa kwa kutumia kiwango chenye nambari inayojulikana ya nakala ya kuanzia, ambapo kiwianishi cha mlalo kinawakilisha logariti ya nambari ya nakala inayoanza na kiwima cha kuratibu kinawakilisha thamani ya Ct kama inavyoonyeshwa kwenye kielelezo kilicho hapa chini.

Kwa hiyo, kwa kupata thamani ya Ct ya sampuli isiyojulikana, nambari ya nakala ya kuanzia ya sampuli hiyo inaweza kuhesabiwa kutoka kwa curve ya kawaida.

Thamani ya Ct si mara kwa mara na inaweza kuathiriwa na sampuli tofauti na vyombo tofauti, hata kama sampuli sawa inarudiwa mara 2 kwenye chombo kimoja, thamani ya Ct inaweza kutofautiana.

Vipimo vya kiasi cha umeme: Vipimo vya kiasi cha umeme vinaweza kugawanywa katika vichunguzi vya umeme na rangi za fluorescent kulingana na alama zinazotumiwa.Uchunguzi wa fluorescent ni pamoja na teknolojia ya Beacon (teknolojia ya beacon ya molekuli, inayowakilishwa na American Tagyi), TaqMan probes (inayowakilishwa na ABI) na teknolojia ya FRET (inayowakilishwa na Roche);rangi za fluorescent ni pamoja na rangi za fluorescent zilizojaa na rangi za fluorescent zisizojaa, mwakilishi wa kawaida wa rangi za fluorescent zisizojaa ni SYBRGreen I, ambayo hutumiwa kwa kawaida sasa;iliyojaa Mwakilishi wa kawaida wa rangi za umeme zisizojaa ni SYBRGreenⅠ;rangi za fluorescent zilizojaa ni EvaGreen, LCGreen, nk.

SYBRGreenI ni rangi inayofunga DNA inayotumika kwa kawaida kwa PCR ya umeme, ambayo huunganisha isiyo mahususi na DNA yenye nyuzi mbili.Katika hali yake huria, SYBRGreenI hutoa fluorescence dhaifu, lakini mara tu inapofungwa kwa DNA yenye ncha mbili, fluorescence yake huongezeka mara 1000.Kwa hivyo, mawimbi ya jumla ya umeme yanayotolewa na mmenyuko ni sawia na kiasi cha DNA yenye ncha mbili iliyopo na huongezeka kadiri bidhaa ya ukuzaji inavyoongezeka.

Manufaa ya rangi mbili za kuunganisha DNA: muundo rahisi wa majaribio, vianzio 2 pekee vinavyohitajika, hakuna haja ya kubuni vichunguzi, hakuna haja ya kubuni vichunguzi vingi kwa ajili ya majaribio ya haraka ya jeni nyingi, uwezo wa kufanya uchanganuzi wa kiwango cha myeyuko, kupima umaalum wa mmenyuko wa ukuzaji, gharama ya chini ya awali, ujumla mzuri na kwa hivyo hutumiwa zaidi katika utafiti nyumbani na nje ya nchi.

Mbinu ya uchunguzi wa fluorescent (mbinu ya Taqman): Ukuzaji wa PCR unapofanywa, jozi ya vianzio huongezwa pamoja na uchunguzi maalum wa fluorescent.Wakati uchunguzi umekamilika, ishara ya fluorescence iliyotolewa na kikundi cha waandishi wa habari inachukuliwa na kikundi kilichozimwa na haipatikani na chombo cha PCR;wakati wa ukuzaji wa PCR (katika awamu ya upanuzi), shughuli ya upasuaji wa 5'-3' ya kimeng'enya cha Taq huharibu uchunguzi kwa njia ya enzymatically, na kufanya mwandishi wa kikundi cha fluorescence na kuzima kikundi cha fluorescence.

Maombi ya PCR ya kiasi cha umeme.

Utafiti wa biolojia ya molekuli:

1. Uchambuzi wa asidi ya nucleic ya kiasi.Uchambuzi wa kiasi na ubora wa magonjwa ya kuambukiza, ugunduzi wa vijidudu au virusi vya pathogenic, kama vile janga la hivi karibuni la mafua A (H1N1), kugundua nambari za nakala za jeni za mimea na wanyama wanaobadilika, kugundua viwango vya uanzishaji wa jeni la RNAi, n.k.

2. Uchambuzi wa usemi wa jeni tofauti.Ulinganisho wa tofauti za usemi wa jeni kati ya sampuli zilizotibiwa (kwa mfano, matibabu ya dawa, matibabu ya mwili, matibabu ya kemikali, n.k.), tofauti za usemi wa jeni maalum katika awamu tofauti na uthibitisho wa safu ndogo ya cDNA au matokeo ya usemi tofauti.

3. SNP kugundua.Ugunduzi wa polymorphisms ya nyukleotidi moja ni muhimu kwa uchunguzi wa uwezekano wa mtu binafsi kwa magonjwa tofauti au majibu ya mtu binafsi kwa dawa maalum, na kwa sababu ya muundo wa busara wa beacons za molekuli, mara taarifa ya mlolongo wa SNP inajulikana, ni rahisi na sahihi. tumia mbinu hii kwa ugunduzi wa ubora wa juu wa SNP.

4. Kugundua methylation.Methylation inahusishwa na magonjwa mengi ya binadamu, haswa saratani, na Laird aliripoti mbinu inayoitwa Methylight, ambayo hushughulikia DNA kabla ya ukuzaji ili cytosine isiyo na methylated iwe uracil na cytosine ya methylated haiathiriwi, kwa kutumia vitangulizi maalum na uchunguzi wa Taqman kutofautisha kati ya DNA ya methylated na isiyo na methylated. .nyeti zaidi.

Utafiti wa matibabu:

1. Utambuzi wa ujauzito: watu hawawezi kutibu magonjwa ya urithi yanayosababishwa na nyenzo za urithi zilizobadilishwa, na hadi sasa, wanaweza tu kupunguza idadi ya watoto wagonjwa wanaozaliwa kupitia ufuatiliaji wa ujauzito ili kuzuia tukio la magonjwa mbalimbali ya urithi.Hii ni njia isiyo ya uvamizi ambayo inakubaliwa kwa urahisi na wanawake wajawazito.

2. Ugunduzi wa vimelea vya ugonjwa: Upimaji wa kiasi cha umeme wa PCR huruhusu uamuzi wa kiasi wa vimelea kama vile gonococcus, Klamidia trachomatis, Mycoplasma solium, virusi vya papiloma ya binadamu, virusi vya herpes simplex, virusi vya upungufu wa kinga ya binadamu, virusi vya hepatitis, virusi vya mafua, Mycocycyculosis, tubervirus ya EB na tuber.Ina faida za usikivu wa juu, saizi ya chini ya sampuli, kasi na unyenyekevu ikilinganishwa na mbinu za jadi za majaribio.

3. Tathmini ya ufanisi wa madawa ya kulevya: uchambuzi wa kiasi wa virusi vya hepatitis B (HBV) na virusi vya hepatitis C (HCV) inaonyesha kwamba uhusiano kati ya mzigo wa virusi na ufanisi wa dawa fulani.Ikiwa kiwango cha seramu ya HBV-DNA hupungua wakati wa matibabu ya lamivudine na kisha kuongezeka tena au kuzidi kiwango cha awali, ni dalili ya mabadiliko ya virusi.

4. Uchunguzi wa onkojenetiki: Ingawa utaratibu wa ukuzaji wa uvimbe bado hauko wazi, inakubalika sana kwamba mabadiliko katika jeni husika ndiyo sababu kuu ya mabadiliko ya onkogenic.Kuongezeka kwa kujieleza na mabadiliko ya oncogenes inaweza kuonekana katika hatua za mwanzo za tumors nyingi.PCR ya kiasi cha fluorescence ya wakati halisi haifaulu tu katika kugundua mabadiliko katika jeni, lakini pia inaweza kutambua kwa usahihi usemi wa onkojeni.Njia hii imetumika kugundua usemi wa aina mbalimbali za jeni ikiwa ni pamoja na jeni ya telomerase hTERT, jeni ya kudumu ya granulocytic leukemia WT1, jeni ya oncogenic ER, jeni ya PSM ya saratani ya kibofu, na jeni za virusi zinazohusiana na tumor.

Ilitafsiriwa na www.DeepL.com/Translator (toleo lisilolipishwa)


Muda wa kutuma: Juni-21-2022